В 1587 году правнук боярина Солтана Ярослав Иванович продал часть Жировичского имения своему брату Ивану Ивановичу. В купчей крепости говорится, кроме всего прочего: «…и с половицею монастыря церкви Жировицкия, накладом церковным, также и с подданными монастырскими…».
Многие несчастья обрушились на монастырь в начале XVII века. Разорившийся Иван Солтан заложил Жировичское имение кобринскому шляхтичу Ицхаку Михелевичу; затем владение перешло его вдове Эстери и сыну Михелю. В этот период насельники монастыря временно покинули обитель, не желая быть под их началом. Православная иерархия и духовенство были в Польско-Литовском государстве в столь тяжком положении с середины XVI столетия, не имея возможности защитить обитель.
После объединения Литвы с Польшей в 1386 году, вследствие женитьбы князя Литовского Ягайлы на польской королеве Ядвиге, в Западном крае началось насильственное насаждение католицизма, а затем униатства. Ягайло, приняв католичество, дал обязательство привести под власть папы всех своих подданных как в Литве, так и в принадлежавших ему частях Белой и Малой Руси.
В 1605 году мстиславский каштелян Иван Мелешко выкупил Жировичское имение и монастырь у Эстери Михелевич, руководствуясь, судя по некоторым источникам, прежде всего материальной заинтересованностью. Подпав под влияние настоятеля соседнего базилианского монастыря в Бытене Иосафата Кунцевича, Мелешко принял униатство и пожертвовал Жировичи вместе с церковью и чудотворной иконой Иосафату — одному из активнейших деятелей униатства, прозванному за свою жестокость «душехватом» и убитому жителями Витебска, доведенными им до отчаяния. Мелешко вчерне закончил строительство большой каменной церкви, а также построил дом для братии.
Уния, как известно, была подписана 6 октября 1596 года на Брестском Соборе, несмотря на полное нежелание и несочувствие ей со стороны православного населения. Жировичский монастырь оставался православным до 1609 года, когда после решения трибунального суда настоятель монастыря был отправлен в Вильно, где и подписал признание власти римского ставленника – митрополита Ипатия (Потея). Вскоре в Жировичах появились униатские монахи, а в 1613 году Иосафат Кунцевич был назначен настоятелем Жировичского монастыря.